關(guān)于湘智
About Us離心機(jī)用于植物組織蛋白質(zhì)的提取
更新時(shí)間：2012-08-24 點(diǎn)擊次數(shù)：3235次
一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法（summer）
1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。
3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清夜，樣品制備完成。
蛋白質(zhì)提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8）45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！
二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法（summer）
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮，搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。
4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br />
藥品：
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！
組織：腸黏膜（newinbio）
目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min
離心：12000g，10min，4度，棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振蕩，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清
重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇2ml
充分振蕩混勻，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
離心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存（或可直接用于WESTERNBLOT）
存在的問(wèn)題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。
解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。
植物材料：水稻苗，葉鞘，根（ynibcas）
1、200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重復(fù)離心5min
lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
蛋白質(zhì)樣品制備（sigma）
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%（丙酮配制），混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮（所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可調(diào)）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫蘇糖醇），2%Ampholine（AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10），6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度（溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存
六、
植物根中蛋白質(zhì)的抽?。╬henol）
?。?）sample,液氮研磨
（2）裝1.5mlcentrifuge用tube
?。?）加1MKH2PO4+K2HPO4700ul
（4）12000rpm,4度,10-15minite
?。?）取上層液，蛋白質(zhì)就在里面
七、
材料：細(xì)菌蛋白（puc18）
用甲醇提取的，凍干后用緩沖液溶解的。樣品緩沖液是一般的。其中含又2%的SDS。
來(lái)源：低速離心機(jī)
1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。
3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清夜，樣品制備完成。
蛋白質(zhì)提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8）45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！
二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法（summer）
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮，搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。
4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br />
藥品：
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！
組織：腸黏膜（newinbio）
目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min
離心：12000g，10min，4度，棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振蕩，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清
重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇2ml
充分振蕩混勻，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
離心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存（或可直接用于WESTERNBLOT）
存在的問(wèn)題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。
解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。
植物材料：水稻苗，葉鞘，根（ynibcas）
1、200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重復(fù)離心5min
lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
蛋白質(zhì)樣品制備（sigma）
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%（丙酮配制），混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮（所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可調(diào)）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫蘇糖醇），2%Ampholine（AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10），6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度（溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存
六、
植物根中蛋白質(zhì)的抽?。╬henol）
?。?）sample,液氮研磨
（2）裝1.5mlcentrifuge用tube
?。?）加1MKH2PO4+K2HPO4700ul
（4）12000rpm,4度,10-15minite
?。?）取上層液，蛋白質(zhì)就在里面
七、
材料：細(xì)菌蛋白（puc18）
用甲醇提取的，凍干后用緩沖液溶解的。樣品緩沖液是一般的。其中含又2%的SDS。
來(lái)源：低速離心機(jī)
會(huì)員_a.png)